Le attività di ricerca corrente dello IOV nel periodo 2016-2018 si sono sviluppate secondo le linee di ricerca già in atto nel 2016 e quelle approvate per il triennio 2018-2020. Esse non si discostano molto tra loro, anche se nelle nuove sono stati resi più evidenti i settori emergenti della ricerca oncologica. Con il contributo 5 per mille sono state finanziate ulteriori attività di ricerca traslazionale, che fino al 2018 hanno in qualche modo anticipato quelle che sarebbero diventate le linee di ricerca 2018-2020.

A questi finanziamenti si sono sommati il contributo ministeriale “Conto capitale – Oncologia Traslazione 2.0” finalizzato alla creazione di un laboratorio per lo studio della genomica dei tumori e i contributi in conto capitale 2015, sia proposti da noi, che relativi alla proposta della rete oncologica nazionale Alleanza Contro il Cancro (ACC). In coerenza con questo filone di studio, nel 2015 è stata data attuazione a una convenzione con la Fondazione Città delle Speranza che ha reso disponibile allo IOV il 7° semipiano ovest della Torre della Ricerca di Padova; il nostro Istituto occupa ora l’intero 7° piano. In questi spazi sono collocati il laboratorio di genetica molecolare endocrina della UOSD Tumori Ereditari e il laboratorio dedicato allo studio delle cellule tumorali circolanti della UOC Immunologia e Diagnostica Molecolare Oncologica, creando, di fatto, il core lab di genomica del tumore. La nuova piastra per il servizio di genomica dei tumori dello IOV è utilizzata anche per l’attuazione dell’iniziativa Cancer Genomics di ACC. In questo ambito il laboratorio è impegnato nella validazione di pannelli NGS (sequenziamento massivo parallelo) per lo studio dettagliato delle mutazioni del tumore.

L’altro grande argomento di ricerca è, per lo IOV, quello del ruolo del sistema immunitario nello sviluppo e nella terapia del cancro, stimolato dalla disponibilità di farmaci in grado di rimuovere quei meccanismi di elusione che evitavano al tumore di essere aggredito dal sistema immunitario. Uno degli aspetti sui quali ci stiamo particolarmente soffermando è quello di caratterizzare biomarcatori in grado di predire la risposta a un particolare farmaco immunologico e trattare di conseguenza molte diverse neoplasie. È coordinata da oncologi IOV, tra l’altro, la prima sperimentazione mondiale sul trattamento con farmaci immunologici di una forma particolare di tumore della mammella.

Nel corso del 2018 la Direzione Scientifica ha dato avvio, in coerenza con le nuove linee di ricerca che contemplano tra i vari argomenti anche “Big Data”, a un programma di radiomica con la costituzione di un gruppo multidisciplinare composto da radiologi, fisici, matematici ed oncologi che si è coordinato e sta producendo dati molto interessanti su un algoritmo di predizione della riposta a inibitori del check point immunitario in pazienti con cancro del polmone.

Razionale

È ormai ben noto che il cancro è essenzialmente una malattia del genoma, al cui interno possono progressivamente accumularsi quelle mutazioni che alla fine porteranno alla trasformazione delle cellule normali in maligne. Ed è sempre nel genoma, in particolare nella combinazione delle differenti alterazioni genetiche a cui va incontro il DNA durante il processo di trasformazione e progressione tumorale, che si possono riscontrare le caratteristiche in grado di rendere tanto diverse due forme distinte di cancro. Nel genoma neoplastico, pertanto, si possono rinvenire informazioni importanti per comprendere meglio la biologia dei tumori, tratti caratteristici che permettono di identificarne con precisione le diverse forme e consentono di prevederne il decorso clinico, e anche elementi critici per l’individuazione di bersagli specifici contro cui progettare e sviluppare farmaci altamente selettivi. In definitiva, la profilazione genetica del tumore è un elemento essenziale per una moderna medicina oncologica di precisione. In questo contesto, da tempo lo IOV è attivamente coinvolto sia nello sviluppo di modelli cellulari di neoplasia in grado di riproporre quegli stessi tratti molecolari riscontrabili nell’organismo dai tumori di interesse, sia nella profilazione genetica e molecolare dei pazienti, con l’obiettivo generale di determinare quelle differenze genetiche che consentano di prospettare la giusta sequenza o combinazione di terapie da utilizzare per progettare un attacco multiplo a più bersagli, in grado di superare le limitazioni di una singola strategia terapeutica. Questi aspetti sono attualmente in corso di forte implementazione grazie, in particolare, all’acquisizione di tecnologie avanzatissime per gli studi di genomica, quale la metodica di sequenziamento del DNA di ultimissima generazione (NGS), in grado di consentire il sequenziamento dell’intero genoma in brevissimo tempo.

D’altra parte, gli aspetti relati all’evoluzione mutazionale del genoma non impattano solamente nella trasformazione e progressione tumorale, ma presentano anche importanti ricadute in ambito immunologico ed immunoterapeutico. In effetti, l’armamentario terapeutico oncologico si è recentemente arricchito con l’aggiunta di alcuni anticorpi monoclonali (mAb) che agiscono essenzialmente “attivando” le risposte immunitarie endogene nei confronti della neoplasia. Questi cosiddetti inibitori dei checkpoint immunologici (ICI) sono mAb in grado di prevenire l’inibizione a feedback delle cellule T attivate, con il risultato di favorire la risposta immune al tumore; inoltre, dati recenti indicano che, nei pazienti rispondenti, gli ICI sono in grado di stimolare risposte T cellulari protettive e terapeutiche dirette contro neoantigeni tumorali derivanti da mutazioni di normali proteine della cellula neoplastica, che risultano in questo modo comportarsi come antigeni altamente tumore-specifici. Queste osservazioni presentano potenziali importanti ricadute, in quanto permettono di prospettare, da una parte, la possibilità di individuare profili di espressione antigenici specificamente individuali sulla base dei quali proporre interventi immunoterapeutici strettamente personalizzati, dall’altra parte, di concepire terapie combinatoriali tra ICI e approcci vaccinali e/o terapie adottive con cellule T in grado di favorire l’espansione e la funzionalità di popolazioni effettrici altamente efficaci.

Infine, strettamente correlata alla profilazione immunogenetica delle neoplasie, la profilazione cellulare del contesto tumore-stroma, con l’intento di ottenere una valutazione quali-quantitativa (immunoscore) delle popolazioni immuni infiltranti, rappresenta un altro punto cardine della moderna ricerca immuno-oncologica volta all’identificazione di biomarcatori predittivi di risposta.

Complessivamente, tuttavia, sia il sequenziamento genomico e immunogenetico sia l’immunoprofilazione cellulare e infine i dati clinici con cui correlare i risultati, vengono a costituire quelli che in gergo tecnico vengono indicatati come big data, enormi quantità di dati che vengono prodotti e raccolti in modo ordinato grazie all’aiuto dei computer e che rappresentano una preziosa fonte di informazioni purché si sia capaci di interrogarli nel modo giusto per distillarne le risposte desiderate. In questo contesto, la bioinformatica sta aprendo le porte a scenari estremamente interessanti, ponendosi all’interfaccia tra le tecniche di sequenziamento del DNA e lo sviluppo di software in grado di analizzare i big data, aspetti fondamentali per compiere un grande passo in avanti verso la medicina oncologica di precisione. Proprio in oncologia, infatti, l’analisi su larga scala dei big data è considerata come la base per una vera e propria rivoluzione nella cura della malattia, grazie alla possibilità di analizzare dettagli molecolari e clinici con una precisione mai raggiunta prima.

Se, da un punto di vista tecnico, la genomica dei tumori è in corso di rapida implementazione nel nostro paese e nel nostro Istituto, tuttavia centri specificamente dedicati all’analisi high throughput sono relativamente rari e scarsamente interdigitati con strutture di bioinformatica. Sul versante prettamente clinico e clinico-patologico, l’introduzione degli ICI nella pratica terapeutica corrente sta drasticamente modificando le aspettative di trattamento in alcuni ambiti oncologici, ma al contempo richiede sempre più urgentemente di identificare biomarcatori predittivi di risposta in grado di guidare la selezione dei pazienti, al fine di razionalizzare e personalizzare le terapie nell’ottica sia dei profili di tossicità che dell’economicità per il Sistema Sanitario Nazionale. Sul versante immunologico ed immunoterapeutico, inoltre, queste considerazioni sono ulteriormente aggravate dalla relativa assenza di una cultura scientifica incentrata sullo sviluppo di nuove tecniche di immunoterapia cellulare adottiva e di adeguate strutture dove sviluppare la produzione di farmaci cellulari ad uso terapeutico.

Lo IOV ha favorito studi di ricerca traslazionale finalizzati a:

  • implementare approcci di genomica dei tumori altamente personalizzati;
  • identificare biomarcatori di risposta alla terapia con ICI;
  • integrare i dati prodotti in ambito bioinformatico;
  • mettere a punto di approcci di immunoterapia cellulare adottiva potenzialmente traslabili alla pratica clinica.

Nello specifico, sono oggetto di supporto le ricerche nei principali ambiti oncologici attualmente investiti dall’uso di ICI, quali il melanoma, il carcinoma polmonare, mammario, colorettale e prostatico. Grazie ai programmi “Conto Capitale” 2013 e 2015, lo IOV si è dotato di una sofisticata piattaforma di analisi genomica high-throughput, e pertanto i principali ambiti di intervento riguarderanno sia la profilazione genetica che l’immunoprofilazione nel sangue periferico e nel tessuto neoplastico, nell’ottica di identificare profili di espressione genica e immunoscore molecolari predittivi di risposta e/o tossicità.

Al contempo, il programma “Conto Capitale” 2015 sta permettendo allo IOV di dotarsi di una sofisticata apparecchiatura per “digital and quantitive pathology”, che consente di visualizzare e quantificare segnali multipli in immunofluorescenza su un medesimo campione (differenti subset linfocitari, pathway immunosoppressivi, marcatori di funzionalità/attivazione, componenti dell’immunità innata, ligandi degli ICI) e permetterà quindi la conduzione di studi clinici multicentrici anche in senso retrospettivo su materiale di archivio. In effetti, se da un lato numerose evidenze dimostrano l’esistenza di una associazione positiva tra la presenza di linfociti infiltranti il tumore (TIL) e una prognosi migliore in tipi differenti di tumori solidi, dall’altro lato sta assumendo un ruolo sempre più importante la determinazione dell’espressione, a livello sia della componente neoplastica sia linfocitaria infiltrante, delle molecole critiche (CTLA-4, PD-1, PD-L1) che rappresentano il bersaglio degli ICI.

La necessità di dare un senso biologico all’enorme massa di informazioni che saranno prodotte e di integrarle e correlarle con i dati clinici rappresenta un altro obiettivo critico del progetto che si prefigge quindi di supportare anche una struttura di bioinformatica, attualmente in corso di implementazione presso il nostro Istituto grazie all’apporto di fondi privati.

Inoltre abbiano sostenuto studi volti ad implementare approcci di immunoterapia cellulare adottiva, basati su cellule T tumore-specifiche ottenute mediante ingegnerizzazione genetica con TCR o chimeric antigen receptor, o su cellule citotossiche geneticamente non modificate ma caratterizzate da elevata attività antineoplastica (cellule NK, cellule CIK), la cui produzione ed espansione su larga scala risulta molto semplificata a livello tecnico e a basso costo. Su quest’ultimo aspetto, vista la rilevanza nazionale assunta dal programma CAR-T, si riportano in seguito maggiori dettagli.

Programma CAR-T

Attualmente i linfociti T armati con CAR rappresentano una delle frontiere più avanzate della ricerca oncoematologica. Lo sviluppo di terapie CAR-T nei tumori solidi, invece, è ancora una sfida poiché finora è risultato molto più difficile conseguire i medesimi effetti terapeutici positivi osservati nelle neoplasie ematologiche. Allo IOV gli sforzi in questo ambito si sono accentrati sul tumore della prostata (PC) e sull’antigene prostatico specifico di membrana (hPSMA, human prostate specific membrane antigen). HPSMA rappresenta uno dei biomarcatori più promettenti nella diagnosi e nel trattamento del PC e la sua rilevanza clinica è attualmente valutata in diversi studi di immunoterapia. HPSMA è una proteina di membrana integrale di tipo II di 100 kDa con una coda citoplasmatica di 19 aminoacidi, prevalentemente localizzata sulle cellule epiteliali della ghiandola prostatica. Nelle cellule normali epiteliali della prostata vi è una bassa espressione di hPSMA, che invece aumenta notevolmente nei tumori della prostata di alto grado, metastatici e androgeno-insensibili. L’importanza di hPSMA quale bersaglio ottimale di interventi terapeutici risiede anche nell’evidenza che esso è assente sulle cellule endoteliali normali ed è invece espresso sull’endotelio di neovascolarizzazione di numerosi tumori di differente istotipo, permettendo quindi di prospettare che il suo targeting possa risultare utile in diverse condizioni cliniche.

Sulla base della accessibilità ad uno dei migliori anticorpi monoclonali (mAb) anti-hPSMA (D2B) presenti a livello internazionale, sono state sviluppate progettualità volte a utilizzare le regioni variabili di questo mAb per la costruzione del frammento variabile a singola catena (scFv), da utilizzare sia sotto forma di proteina ricombinante per scopi diagnostici/terapeutici sia per lo sviluppo di un CAR per immunoterapia adottiva. Con riferimento a questo ultimo aspetto, il primo progetto di cui ci siamo occupati è stato proprio la creazione e la messa a punto di un CAR di seconda generazione, di cui abbiamo dimostrato la validità e la specificità non solo in vitro ma anche in vivo.

Un secondo progetto di ricerca è stato dedicato allo sviluppo di un recettore di terza generazione. L’approccio ha previsto l’inserimento di una seconda molecola co-stimolatoria, il 4-1BB, tra il CD28 e la catena zeta. Questo CAR risulta pienamente funzionale e sono tuttora in corso in laboratorio studi volti a valutarne comparativamente l’efficacia in vitro e in vivo nei confronti della versione di seconda generazione. In oncoimmunologia è ben noto il fenomeno dell’immunoediting, in cui la pressione selettiva del sistema immune è in grado di “scolpire” la neoplasia favorendo l’insorgenza di varianti clonali, che perdono l’espressione di antigeni riconosciuti come meccanismo di escape e sopravvivenza. Poiché tale evenienza potrebbe verificarsi anche nel caso di trattamenti con CAR-T, un terzo approccio che stiamo perseguendo ha previsto la costruzione di un vettore lentivirale che consente l’espressione coordinata e contemporanea di due CAR da parte dei linfociti T tradotti. Abbiamo quindi generato un secondo recettore chimerico contro un altro antigene: il hPSCA (Prostate Stem Cell Antigen). Il hPSCA è una proteina di 123 aa ancorato alla membrana come molecola GPI e appartenente alla famiglia Thy-1/Ly-6, con un presunto ruolo nella trasduzione del segnale e/o adesione cellulare; esso è presente a basso livello sulle cellule normali basali/secretorie della prostata, ma la sua espressione aumenta nelle cellule tumorali del PC e nelle metastasi ossee da carcinoma prostatico. Le evidenze sperimentali finora raccolte sono molto incoraggianti ed evidenziano che le cellule T trasdotte esprimono in maniera coordinata entrambi i CAR (anti-hPSMA e anti-hPSCA), ed esercitano una elevata e specifica attività litica nei confronti di linee tumorali PSCA+ e/o PSMA+.