Genetica e genomica del cancro

Studio biologico, funzionale e molecolare del compartimento circolante dei tumori solidi

Lo studio delle cellule tumorali riversate nel torrente circolatorio dai tumori solidi ha indubbiamente aperto una finestra sull’evoluzione della malattia neoplastica, passando dalla quantificazione del carico tumorale nel sangue periferico come marcatore prognostico e predittivo di efficacia del trattamento, allo studio della eterogeneità tumorale e dell’insorgenza della resistenza ai farmaci, sia a livello cellulare che di DNA libero. L’attività del laboratorio CTC è focalizzata:

  • sullo sviluppo di saggi integrati del test standard, per la quantificazione di “druggable” CTC (EML4-ALK, IGF1R, RANK, gH2AX);
  • sulla determinazione dei cut-off ancora ignoti per patologia (tumore renale, Melanoma, NSCLC);
  • sullo sviluppo di procedure per l’analisi molecolare single-cell;
  • sulla complementarietà delle CTC e del cfDNA (Melanoma, NSCLC);
  • sullo studio di modelli veterinari.

Il laboratorio ha partecipato a progetti europei di 7PQ (CTCtrap) e IMI (CANCER_ID) ed a consorzi europei impegnati nella validazione dei valori di cut-off delle CTC per patologia (EPAC, metanalisi CTC nel tumore mammario; gruppo europeo per la metanalisi nel NSCLC).

Applicazione della biopsia liquida e delle tecniche NGS nel carcinoma polmonare

Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e la possibilità di utilizzare metodiche molecolari ad elevata sensibilità quali la digital droplet PCR (ddPCR) per dimostrare l’esistenza di mutazioni tumorali a livello del DNA estratto da un campione di plasma, aprono nuove prospettive sia per la ricerca che per la diagnostica molecolare oncologica. Uno degli ambiti in cui a livello internazionale tali metodiche hanno già dimostrato la loro potenzialità è quello delle neoplasie polmonari. Abbiamo già messo a punto un pannello di 30 geni tra i più rilevanti (driver/actionable) nei tumori polmonari, ed una strategia di analisi bioinformatica adeguata. Le tecniche di NGS sono state infine implementate in numerosi progetti di ricerca, volti a caratterizzare il profilo genetico di neoplasie polmonari rare o a studiare quello di sottogruppi di adenocarcinoma polmonari, in collaborazione con altri gruppi di ricerca esterni allo IOV e nell’ambito del gruppo nazionale di Alleanza Contro il Cancro (ACC).

Applicazione delle tecniche di NGS per l’analisi dei geni BRCA 1 e 2 nel carcinoma ovarico

L’approvazione della somministrazione di Olaparib, inibitore di PARP (poli [adenosina difosfato-ribosio] polimerasi), per il trattamento di “mantenimento” di pazienti con recidiva di carcinoma ovarico epiteliale (EOC) platino sensibile e mutazione patogenetica dei geni BRCA1 e BRCA2 ha determinato un crescente interesse per l’individuazione di mutazioni somatiche a carico di questi geni. Si stima che circa il 6% degli EOC sierosi di alto grado presentino mutazioni somatiche dei geni BRCA1 e 2. Il nostro laboratorio ha recentemente messo a punto questo tipo di analisi NGS su tessuto fissato in formalina e incluso per:

  • caratterizzazione delle mutazioni somatiche e loro interpretazione;
  • fattori genetici, anamnestici e morfologici predittivi di mutazione somatica;
  • correlazione genotipo-fenotipo tra presenza di mutazione somatica e risposta terapeutica;
  • organizzazione del percorso clinico-diagnostico delle pazienti sottoposte al test somatico.

Studio delle caratteristiche genetiche ed epigenetiche del carcinoma colon rettale prima e dopo trattamento con terapia anti-angiogenica

Nel carcinoma colon rettale metastatico (mCRC) le resistenze primarie e secondarie rappresentano un rilevante problema clinico, essendo il tasso di ricorrenza dopo intervento chirurgico e terapia sistemica circa del 50%. Molteplici studi preclinici hanno dimostrato che la terapia anti-angiogenica induce la selezione di cellule con un fenotipo altamente glicolitico e che questo si associa allo sviluppo di resistenza. Mediante tecnologie omiche per la valutazione di profilo mutazionale, assetto cromosomico e stato di metilazione del DNA, questo studio ha lo scopo di chiarire se la variazione metabolica conseguente al trattamento sia correlata alla selezione di cloni di cellule tumorali con particolari caratteristiche genetiche o epigenetiche ed identificare quindi marcatori di risposta e/o resistenza per migliorare la gestione clinica dei pazienti.

Caratterizzazione dei profili di mutazioni somatiche nel carcinoma mammario per identificare nuovi marcatori prognostici e/o predittivi

L’altissimo grado di eterogeneità osservato nei carcinomi mammari rende estremamente complicato suddividere le pazienti in sottogruppi clinici ben definiti e, di conseguenza, concepire più efficaci interventi terapeutici. Diverse strategie di classificazione basate sull’espressione dei recettori ER/PR/HER2 e sull’analisi di profili trascrizionali hanno una riconosciuta rilevanza clinica, tuttavia proprio per la loro natura dinamica spesso producono risultati forvianti. Lo studio delle mutazioni somatiche nel DNA tumorale potrebbe essere utile per una migliore stratificazione delle pazienti e per l’identificazione di nuovi marcatori prognostici e/o predittivi. A tale scopo si sono aperte linee di ricerca in collaborazione con i clinici per:

  • valutare la correlazione fra lo stato mutazionale di PIK3CA e la risposta al trattamento adiuvante con Trastuzumab nell’ambito dello studio Trans-SHORTER;
  • identificare e caratterizzare nuovi possibili marcatori molecolari (ad esempio ESR1, HER2, MAP3K1, GATA3 and CDH1).

Uso del DNA circolante e della tecnica NGS (next generation sequencing) nel monitoraggio di pazienti con esofago di Barrett (EB) e adenocarcinoma dell’esofago (EADC)

La presenza di metaplasia intestinale nell’esofago, nota come esofago di Barrett (EB), è considerata una condizione preneoplastica. Attualmente, la stratificazione del rischio neoplastico nei pazienti con EB si basa sulla diagnosi istologica di displasia che, però, presenta un alto grado di variabilità inter- ed intraosservazionale. Stiamo studiando il DNA circolante plasmatico (biopsia liquida) come fonte di marcatori tumorali in pazienti con EB da analizzare con NGS. L’applicazione della biopsia liquida e di NGS verrà estesa anche a casi di EADC, per monitorare la risposta alla terapia e/o la eventuale ricaduta.

Messa a punto di un test per la diagnosi precoce di adenocarcinoma prostatico basato sul dosaggio di acidi nucleici circolanti

L’uso del PSA nella diagnosi precoce di neoplasie prostatiche è inficiato da scarsa sensibilità e specificità. L’identificazione di nuovi biomarcatori che consentano di scoprire la neoplasia in stadio precoce, predire il rischio di metastasi e recidiva dopo prostatectomia potrebbe rivoluzionare la gestione clinica e aumentare la probabilità di guarigione di questi pazienti. A tal fine abbiamo messa a punto una metodica di rilevamento quantitativo di microRNA in campioni di plasma. Abbiamo identificato un pannello di 3 microRNA in grado di evidenziare la presenza di focolai di adenocarcinoma prostatico con specificità molto superiore al PSA. Gli studi in corso sono mirati alla validazione di questi dati su una ampia casistica prospettica e di identificare altri marcatori circolanti (DNA, RNA) in grado di predire la presenza e il decorso clinico della neoplasia.

Papillomavirus (HPV): cancerogenesi, prevenzione e biomarcatori

Gli HPV (tipi ad alto rischio) sono gli agenti causali di alcuni carcinomi, fra cui tutti i carcinomi della cervice uterina (ICC) e una parte dei carcinomi dell’orofaringe (OPSCC). Un’efficace prevenzione del cervicocarcinoma si avvale sia dello screening con test HPV che dei vaccini anti-HPV; di particolare interesse in questo ambito sono lo studio di biomarcatori virali e cellulari (tipizzazione, metilazione, miRNA) per la definizione del rischio di lesioni delle donne con infezione HPV, e i protocolli di screening delle donne vaccinate. Lo studio degli OPSCC HPV-correlati (associazione causale recente) ha come obiettivo definirne la frequenza (anche nel tempo) e le caratteristiche molecolari in relazione all’outcome clinico, per poter personalizzare i trattamenti.

Studio dei marcatori molecolari predittivi di risposta alla targeted therapy nel melanoma metastatico BRAF mutato

Il trattamento terapeutico con inibitori del pathway MAPK nei pazienti affetti da melanoma metastatico BRAF-mutato, ne ha notevolmente migliorato l’outcome clinico in generale. Tuttavia alcuni pazienti manifestano, subito dopo l’inizio della terapia, una resistenza primaria/intrinseca che li rende non responsivi al trattamento. Con l’obiettivo di individuare marcatori molecolari predittivi di risposta, si è iniziato uno studio retrospettivo in cui si valuta il profilo molecolare dei melanomi BRAF mutati in associazione alla risposta alla targeted-therapy. Il profilo molecolare viene determinato dall’analisi di sequenza in geni coinvolti nel pathway di MAPK (c-KIT, NRAS, MEK), di AKT (PIK3CA, AKT, mTOR, PTEN) e di CDKN2A (p16, p14, CDK4) e dalle variazioni nel numero di copie geniche (CNV copy number variations) mediante analisi genome-wide con metodo OncoScan su piattaforma Affymetrix. Lo studio sarà approfondito, ove possibile, con tecniche di sequenziamento next generation a seconda del materiale biologico a disposizione.

Identificazione di nuovi alleli di predisposizione in famiglie con tumore della mammella/ovaio eredo-familiare

Uno dei fattori di rischio più importanti per i carcinomi della mammella e dell’ovaio è rappresentato dalla familiarità per entrambi i tipi di tumore. L’identificazione degli individui geneticamente predisposti e la definizione del loro rischio di malattia costituisce un obiettivo sanitario di primaria importanza poiché permette l’adozione di strategie di riduzione del rischio e/o di diagnosi precoce con un importante impatto sulla mortalità e morbilità associate a queste malattie. L’alterazione costitutiva dei geni BRCA1 e BRCA2 è responsabile di una parte di queste neoplasie. Lo studio di nuovi geni e la definizione dei meccanismi in grado di modulare il rischio di malattia viene attualmente perseguito tramite i seguenti approcci:

  • SNP e varianti selezionati sulla base di una plausibilità biologica o da dati riportati in letteratura e/o derivanti da studi “genome-wide”, vengono genotipizzati in un’ampia casistica di più di 40.000 carrier di mutazione BRCA1/2 identificati nel contesto del consorzio internazionale CIMBA. Gli studi di associazione vengono condotti in relazione a differenti parametri clinico-patologici quali la presenza e il tipo di tumore, l’età di insorgenza della malattia, le caratteristiche isto-patologiche e il tipo di mutazione, al fine di identificare fattori modificatori del rischio di malattia.
  • Famiglie con numerosi casi di tumore della mammella e/o ovaio e non informative al test BRCA vengono selezionate per lo studio di pannelli genici. Lo screening e la selezione delle varianti geniche identificate viene effettuato tramite algoritmi basati sullo studio della segregazione intra-familiare, il confronto con i dati di sequenziamento depositati nei database internazionali, la predizione in silico dell’effetto della variante e la validazione in un campione più ampio di casi e controlli.
  • Lo studio di varianti di sequenza BRCA1/2 di significato ignoto prevede l’utilizzo di modelli multifattoriali per l’integrazione di dati genetici, clinici, patologici e derivati da analisi di laboratorio per arrivare ad una classificazione, secondo le attuali linee guida, in grado di fornire una possibile indicazione all’utilizzo clinico del dato molecolare.

Studio dei fattori genetici predisponenti al melanoma cutaneo

L’eziopatogenesi del melanoma cutaneo è complessa e multifattoriale, con fattori ambientali e genetici coinvolti. Tra i fattori genetici, oltre ai rari geni ad alta penetranza che rendono conto solo del 22% del rischio per questa malattia, numerosi loci polimorfici (SNPs) sono stati dimostrati agire come modificatori del rischio. Inoltre, recenti e numerosi studi hanno dimostrato che la biologia dei telomeri è importante nel melanoma. A seguito del nostro studio in cui abbiamo dimostrato un duplice opposto ruolo della lunghezza dei telomeri sul rischio di malattia a seconda si tratti della forma familiare o sporadica, si intende valutare:

  • l’associazione tra SNPs presenti in geni associati ai telomeri e lunghezza dei telomeri stessi;
  • l’associazione di questi SNPs con il rischio di melanoma analizzando DNA da casi con forma sia familiare che sporadica di malattia. Le analisi vengono condotte su piattaforma per spettrometria di massa MALDI-TOF con chip a DNA.

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